HPLC分析是系统的工作，每个环节都很重要；看似简单的环节，反而容易疏忽，引起整个实验的结果偏差，因此养成良好的习惯是很重要的。色谱柱是色谱系统的心脏，液相色谱柱的正确安装与使用，是色谱工作的关键；也是获得正确可靠的实验数据的必经之路。

一·液相色谱柱的安装

1         液相色谱柱的结构：

a．空柱由柱接头柱管及滤片组装而成

柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英才外螺纹，另一端是3/16英才的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英才外螺纹与1/4英寸柱管（￠6.35mm）连接，中间放置压环用于密封。3/16英才的内螺纹与1/16英才（￠1.57mm）的连接管连接，之间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用￠1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后在拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上（连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸。

在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片（或滤网），用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

b．  柱填料：

液相色谱柱的分离作用是在填料和流动相之间进行的，柱子的分类是根据填料类型而定。

正相柱：多以硅胶为填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10um的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，—NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他反相填料还有键合C8，C4，C2，苯基等，其颗粒直径在3-10um之间。

2         色谱柱的安装

a．  拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型，尺寸，出厂日期以及柱内储存的溶剂。

b．  拧下柱两端的密封堵头放回包装盒备用。

c．  按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口连接（如条件允许，建议在柱前使用保护柱）；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为.57mm、内径为0.1mm-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈，切记不要用力太大。如色谱柱通过流动相加压后有漏夜现象，请用扳手顺时针拧1/4圈，直至不漏夜为止。

二·液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，进行的柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是*条件），只要这样测试的结果才有可比性。

1         样品的前处理：

a．  使用流动相溶解样品。

b．  使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c．  使用0.45um的过滤膜除去微粒杂质。

2         流动相的配置：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a．  流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。

b．  流动相具有一定的惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。

c．  流动相的黏度要尽量的小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液压泵的使用寿命（可运行提高温度的方法降低流动相的黏度）。

d．  流动相的化学性质要与使用的检测器相适应。如用UV检测器，使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e．  流动相的沸点不要太低，负责容易产生气泡，导致实验无法进行。

f．   在流动相配置好后，一定进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3         流动相流速的选择：

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求*柱效，使用*流速。对内径为4.6 mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。

当选用*流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

1）.由于甲醇的廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系（必须使用乙腈的除外）。

2）.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的乙烷做流动相，没有提纯的乙烷不的使用。用水使用超纯水（电阻率大于18兆欧），去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析的结果。

3）.含水流动相在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。加入*，防止细菌的生长。

4）.流动相要求使用0.45um滤膜过滤，除去微粒杂质。

5）.使用HPLC级溶剂配置流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

4        柱性能的测试：

——启动液相色谱仪：a. 流动相流速设定为1ml/min。

                                    b．UV检测器波长设定为254nm。

——使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。

——记录并计算测试结果。